NPA0103 BCA蛋白浓度测定试剂盒
BCA蛋白浓度测定试剂盒
BCA protein concentration assay kit
产品内容
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货号 |
品名 |
规格 |
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NPA0103-025 |
BCA蛋白浓度测定试剂盒 |
250 T |
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NPA0103-1 |
BCA蛋白浓度测定试剂盒 |
1000 T |
BCA试剂A和试剂B建议置于2 - 8℃保存，也可室温保存。BSA标准溶液可以短期保存在2 - 8℃，长期则置于- 20℃保存。有效期1年。冰袋运输。
产品简介
BCA法是常用的蛋白浓度定量分析方法之一。其原理是，在碱性环境中，蛋白质会与 Cu2+络合，并将 Cu2+还原成 Cu+。蛋白将Cu2+还原成 Cu+的还原力来源于两个方面，其一是肽键，其二是色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等还原性氨基酸的侧链基团。随后两个BCA 分子与一个Cu+ 螯合，形成稳定的蓝紫色复合物，其在 562 nm 波长下有最高的光吸收值，并且该值在一定范围内与蛋白质浓度呈现很好的线性关系，通过带入吸光值换算，可以得出样品中蛋白的浓度。
在标准实验方案下，本试剂盒测定蛋白的范围是50-4000 µg/mL。在测定时，对样品液中5%以内的去垢剂如SDS、Triton X-100、Tween20、Tween80、NP40有很好的耐受力，但易受螯合剂和还原剂的干扰，应保证EDTA浓度≤10 mM、DTT浓度≤1mM、β-巯基乙醇浓度≤0.01%，无EGTA。
产品组分
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组分名称 |
NPA0103-025 |
NPA0103-1 |
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BCA试剂A |
55 mL |
2×110 mL |
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BCA试剂B |
1.2 mL |
5 mL |
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蛋白标准品BSA（5mg/mL） |
1 mL |
2×1 mL |
使用说明（酶标板法）
1.配置蛋白标准溶液
吸取120 μL蛋白标准品，用和待测蛋白样品一致的溶剂，例如裂解液，稀释至300 μL，配置成2mg/mL 的标准样品液。也可以使用0.9% NaCl、PBS或者双蒸水进行稀释。
2.配置BCA工作液
BCA工作液现配现用。根据测量的样品加标样的总孔数计算需要的液体量。每个浓度的标样和待测样品建议测量3次。由于事先未知样品液的浓度，不知道其是否落在检测区间，如果条件允许，可以梯度稀释样品，分别检测。一般考虑到损耗，应多配几个孔，计算方法为，
工作液体积总量＝需要的孔数 × 200 μL。
可以近似认为工作液体积等于试剂A的体积。在离心管中按照试剂 A 和试剂 B 为 50:1 的体积比配置显色工作液，充分混匀后待用。
3定量检测
利用稀释好的2mg/mL 的标准样品液，按照下表的加样体积，在酶标板中配置不同浓度的标样液，保证最终的体积为20 μL。为了添加方便，先添加稀释液。
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编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
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2 mg/mL标准品（μL） |
0 |
1 |
2 |
5 |
7 |
10 |
15 |
20 |
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补加稀释液（μL） |
20 |
19 |
18 |
15 |
13 |
10 |
5 |
0 |
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标样浓度（mg/mL） |
0 |
0.1 |
0.2 |
0.5 |
0.7 |
1 |
1.5 |
2 |
加入待检测的20 μL样品液，设置重复。每孔加入200 μL显色工作液，37℃放置30min。加样时要轻柔，避免出现气泡，如果出现气泡，一般在孵育30min内会自动消除。也可以使用酶标仪的震荡功能混匀。
设置酶标仪的检测波长为562nm，检测每孔的吸光度。
经过空白对照矫正后，即各标准样本吸光度平均值和待测样品吸光度平均值减去编号为1的标准样品吸光度平均值，以标准样品浓度为横坐标，矫正后的吸光度的平均值为纵坐标，绘制散点图并拟合线性标准曲线，计算 R2。如果重复中有过度离群点应当剔除。一般R2>0.99为宜。带入样品的吸光度平均值，计算出样品中蛋白的浓度。
注意事项
1.经过测试，使用兼容浓度的干扰物稀释或溶解标准样品，同样可以获得线性很好的标准曲线（R2>0.99）。如果使用纯水、0.9% NaCl溶液或者PBS溶液替换，会造成计算时的偏差。兼容并不意味此浓度的添加物不造成显著的吸光度值的改变。而利用添加干扰物的标曲，可以真实反应样本液中蛋白的浓度。
2.利用本试剂盒测量RIPA裂解液（强）和RIPA裂解液（弱）提取的蛋白浓度时，几乎不受干扰。
3.在更宽的浓度范围内，蛋白浓度和吸光度并不呈现线性关系。此时可以使用曲线或者多项式拟合，或者低浓度范围和高浓度范围分别使用不同的直线方程拟合。
4.试剂A和试剂B混合，配置工作液时，会有不溶物出现，充分混匀后沉淀消失，配好的 BCA 工作液呈现苹果绿。建议工作液现配现用，配置好后在4℃可以稳定保存24 h。
5.可以改变样品液和工作液的混合比例，比如设定为1：8或者1：20，可以相应节省工作液或者样品，也可以增加或减弱样品液中干扰物的影响。需要注意调整样品液和工作液体积比例会改变可检测的浓度上下限和最佳线性范围。
6.本检测方法不是终点法，所以时间和温度都会对吸光值产生影响。在需要时，可以相应延长显色的时间和反应的温度，但也会改变最佳的线性范围，最佳范围的确立可以通过标曲R2和回代偏差判断。
7.如果使用分光光度计测量吸光度，可以成倍扩大反应体系。建议操作检测时间不要超过10 min，避免其它测量的反应液颜色过度加深。
8.本试剂盒检测方法在原理上存在不可避免的劣势，因为检测过程只反应了肽键和四种氨基酸（半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）的数目，而在多种蛋白混合且比例不同的样品中，吸光度并不能和蛋白实际浓度呈现很好的确定关系。为了提高检测的精度，可以使用相应的蛋白替换BSA。但是相较于Bradford法，相同浓度的不同蛋白间的吸光度变异不算太大。
