逆转录酶的功能是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。这个过程是RNA病毒的复制形式之一，需要逆转录酶的催化。
在逆转录过程中，逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA（主要是色氨酸tRNA）为引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与RNA模板互补的cDNA单链，它与RNA模板形成RNA-cDNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。
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