逆转录pcr的注意事项
逆转录PCR（RT-PCR）是一种用于检测和克隆RNA的强大技术，但在实验过程中需要注意以下几点：
1. 防止RNA的降解：在实验过程中要保持RNA的完整性，因为任何降解都可能会影响逆转录PCR的准确性和灵敏度。
2. 避免mRNA的断裂：在总RNA的提取过程中，要避免mRNA的断裂。因为mRNA是逆转录PCR的主要模板，如果断裂，会影响后续的逆转录反应和PCR扩增。
3. 设立阴性对照：为了防止非特异性扩增，必须设立阴性对照。这可以帮助你判断扩增产物是否是特异性扩增。
4. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
5. 注意离子条件：离子条件基本上影响各种模板的转录效率。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM，最适的二价阳离子浓度是6-10mM。
6. 注意使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的高浓度：对于有效合成cDNA是特别重要的。
7. 注意逆转录酶的选择：对于最适反应温度较低(37℃)的鼠源逆转录酶催化的反应，可能需要用氢氧化甲基汞处理破坏mRNA的二级结构。
以上就是进行逆转录PCR实验时需要注意的事项，希望能对你有所帮助。
