EST文库的构建基本流程及应用
EST文库构建的基本流程：
1. 提取组织总RNA：这一步骤中需要使用RNA提取试剂盒，或者优化的TRIzol方法等，将组织的总RNA提取出来。这个过程中要尽量避免基因组DNA和蛋白的污染。
2. Poly(A)+mRNA的选择：RNA是一类带有Poly-A尾巴的信使RNA（mRNA），通过Poly(A)聚合酶在RNA的3'端加上多聚腺苷酸尾（Poly(A)）。然后通过亲和纯化的方法将Poly(A)+mRNA从总RNA中分离出来。
3. 合成cDNA：将得到的Poly(A)+mRNA进行逆转录，合成cDNA。这一步通常需要使用反转录酶和随机引物。
4. 两端加接头：在cDNA的两端加上特定的接头，以便于后续的克隆和筛选。
5. 与λzap载体的连接：将加好接头的cDNA与λzap载体进行连接，包装和裂解。这一步通常需要使用连接酶、包装酶和裂解液。
6. 转染E.coli的XLI—Blue细胞：将包装好的λzap文库转染进E.coli的XLI—Blue细胞中，进行体内excision。这一步通常需要使用转染液和E.coli的XLI—Blue细胞。
7. 筛选：用含有x-gal和IPTG的氨苄平板筛选出含有重组质粒的白色菌落。
8. 提取质粒：将筛选得到的白色菌落中的重组质粒提取出来。
9. M13活T7通用引物测序：用M13活T7通用引物进行PCR扩增并测序。
EST文库的应用：
EST在基因组学和分子生物学研究中有着广泛的应用：
1. 克隆和定位基因：通过EST序列可以克隆和定位基因。首先，EST序列可以用来寻找基因的序列标签（STS），这是一种用于定位基因的DNA标记。然后，通过比较EST序列和其他物种的基因组序列，可以确定基因的位置和功能。此外，EST序列还可以用来寻找基因的多态性标记，这是一种用于研究基因变异的DNA标记。
2. 研究基因表达：通过比较不同组织或不同发育阶段的EST序列，可以研究基因的表达谱。这种方法可以用来寻找新的基因、研究基因的表达调控以及研究基因的功能。
3. 寻找疾病相关的基因：通过比较患者和正常人的EST序列，可以寻找与疾病相关的基因。这种方法可以用来研究疾病的发病机理、寻找疾病的诊断标记以及研究药物的作用机理等。
4. EST序列在转录组学研究中也有着重要的应用，比如用来构建基因表达谱、寻找差异表达基因等等。
