线粒体rna提取
线粒体RNA(mitochondrial RNA,mtRNA)提取可以使用以下步骤:
1. 细胞/组织样本裂解:将细胞或组织样本转移到离心管中。使用细胞裂解缓冲液或线粒体裂解缓冲液(如Trizol LS),根据样本量加入相应体积的缓冲液。
2. 线粒体富集:对细胞/组织样本进行线粒体富集。可以使用线粒体富集试剂盒或密度梯度离心法等方法来富集线粒体。
3. 裂解线粒体:对富集的线粒体进行裂解,以释放RNA。可以使用裂解缓冲液(如TRIzol)加热裂解,或使用含有蛋白酶K和SDS的裂解缓冲液。
4. 加入氯仿:加入等体积的氯仿。轻轻颠倒混合,使其充分混合。氯仿会分离出DNA和蛋白质,RNA会保留在上清液中。
5. 离心:将混合物离心10-15分钟,在离心过程中形成两个相,上层为无色上清液(含有RNA),下层为有机层(含有DNA和蛋白质)。
6. 收集RNA上清液:使用移液器将上清液转移到新的离心管中。避免将有机相带入RNA上清液中。
7. 洗涤RNA上清液:加入等体积的异丙醇(或乙醇),轻轻颠倒混合。将混合物离心10分钟,倒掉上清液。重复此步骤1-2次,以去除残余的氯仿和其他杂质。
8. 干燥:将管子打开口,在室温下保持开放3-5分钟或使用负压将液体吹干。注意不要使RNA过度干燥,避免降低RNA的质量。
9. 重悬:使用适量的RNase-Free水(或其他合适的缓冲液)重悬RNA沉淀。将管子轻轻颠倒数次,使RNA完全重悬。
10. 质量和浓度检测:使用比色法(如NanoDrop)或荧光分析方法(如Qubit)测量提取的RNA浓度,确保RNA的质量和浓度。
需要注意的是,线粒体RNA的含量较低,因此在提取过程中需要特别小心以避免RNA的降解。使用RNase-Free材料,并尽快进行下一步操作以确保RNA的完整性。