全血rna提取试剂
全血RNA提取是一种从全血样品中提取RNA的方法,通常需要采用适当的试剂和步骤来保护RNA完整性并去除DNA和蛋白质。
以下是一种常见的全血RNA提取方法:
材料和试剂:
1. TRIzol试剂(Invitrogen)或相应的RNA提取试剂
2. 液氮
3. 75%乙醇
4. DEPC处理的水
5. RNase除去剂
6. DNase消化试剂、酶停止缓冲液(optional)
实验步骤:
1. 采集全血样品,尽量避免血细胞破裂和RNA降解。可以使用抗凝剂(例如EDTA)处理全血样品,并注意样品的保存条件。
2. 快速冷冻全血样品,将其浸入液氮中并保存在-80℃冷冻保存。
3. 取出冷冻的全血样品,将其快速置于细砂浴中恢复至0℃。
4. 加入适量的TRIzol试剂或相应的RNA提取试剂,根据试剂说明书的推荐量。
5. 彻底混合样品并在室温下孵育5分钟。
6. 加入氯仿,根据样品体积的1/5至1/4加入相应体积的氯仿。密封管子,摇匀混合至均匀混合。
7. 在室温下孵育10分钟以使上清液相分离。
8. 将样品离心10分钟(12000-15000 x g,4℃),以分离出上清液、DNA和蛋白质沉淀。上清中富集了RNA。
9. 转移上清液至新的离心管中,加入适量的75%乙醇,使其终浓度达到70%。
10. 缓慢地倒入适量的上清液-乙醇混合物(通常是样品体积的1.5倍)至RNA绑定柱或旋转柱上。
11. 离心柱子15秒,将底部的乙醇排出。
12. 加入适量的RNase-free洗涤缓冲液来洗涤绑定柱,然后再次离心15秒,将底部液排出。
13. 在绑定柱上进行洗涤过程,根据试剂盒的说明进行操作。
14. 加入适量的DEPC处理的水或RNase-free水(根据试剂盒说明)至绑定柱中,等待1分钟后离心柱子30秒,最后的RNA即可在柱子底部的管中收集。
15. 如果需要去除DNA污染,可以进行DNase消化步骤。
16. 使用吸光光度计或凝胶电泳等方法检测RNA的质量和浓度。
注意事项:
1. 在操作过程中使用RNase-free的试剂和工具,以防止RNA降解。
2. 所有设备和材料应该是DEPC处理过的,以去除RNase。
3. 保持试剂和样品的低温,以防止RNA降解。
4. 注意全血样品中可能存在红细胞、白细胞、血小板、血浆等成分,可以根据实验的需求选择适当的方法去除或富集RNA。
以上是一种常见的全血RNA提取方法,具体步骤和试剂可以根据实验的需求和试剂盒的说明进行调整。