miRNA靶点3’UTR构建
构建miRNA靶点的3'UTR片段通常用于研究miRNA对特定基因的调控作用。以下是构建miRNA靶点3'UTR片段的一般步骤：
1. 获取目标基因的3'UTR序列：首先，需要获取目标基因的完整mRNA序列。可以通过数据库（如NCBI、Ensembl等）或实验室内已有的序列数据获取目标基因的mRNA序列。然后，从该mRNA序列中截取目标基因的3'UTR序列。
2. 插入miRNA靶点库：miRNA靶点通常位于3'UTR的某个位置，通过插入人工合成的miRNA靶点到目标基因的3'UTR序列，可以构建含有miRNA靶点的3'UTR片段。
3. 克隆构建：将含有miRNA靶点的3'UTR序列克隆到适合的载体中，例如质粒或病毒载体。在克隆的过程中，可以插入适当的标记（如荧光蛋白基因）或报告基因（如luciferase）来方便后续研究miRNA靶点的调控效果。
4. 测序验证：对构建好的miRNA靶点3'UTR片段进行测序验证，确保插入的miRNA靶点序列与设计一致。
5. 功能鉴定：使用该构建的miRNA靶点3'UTR片段进行功能鉴定实验。常见的功能鉴定方法包括荧光报告基因分析、Western blot、RT-qPCR等。这些方法可以用来分析miRNA对目标基因表达的调控效果。
需要注意的是，在构建miRNA靶点3'UTR片段时，应考虑miRNA靶点的选择和位置。miRNA靶点序列通常富含A与T，同时需要考虑miRNA靶点与3'UTR序列的互补性。此外，还应该考虑miRNA靶点与目标基因的调控效果与机制的一致性，并和已有实验数据进行验证和比对。
