免疫共沉淀input与ip
在免疫共沉淀(immunoprecipitation, IP)实验中,通常需要使用两个样品进行比较:input样品和IP样品。
1. Input样品(输入样品):是原始细胞或组织的总提取物。这个样品用于测定目标蛋白质的总量,即在细胞中的起始丰度。它是未经免疫沉淀步骤处理的,所以其中的蛋白质是未被抗体选择的,包括目标蛋白质和其他非特异性结合蛋白质。
2. IP样品(免疫沉淀样品):是经过免疫沉淀和洗涤步骤处理后的细胞或组织提取物。在IP过程中,目标蛋白质与特异性抗体结合,然后通过蛋白质A/G琼脂糖珠等介质将蛋白质-抗体复合物沉淀下来。然后,通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质,最后通过洗脱步骤将目标蛋白质从抗体上释放出来。
通过比较input样品和IP样品中对目标蛋白质的检测,可以确定该蛋白质与其他蛋白质的特异性相互作用。常用的检测方法包括免疫印迹(Western blot)和质谱分析等。
在染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中,input和IP的概念也存在,但它们针对的是目标蛋白质与DNA相互作用的情况。
1. ChIP Input样品:是通过染色质交联、裂解和消化得到的DNA片段提取物。input样品是染色质中所有DNA的总体,包括与目标蛋白质相互作用的片段和未与目标蛋白质相互作用的片段。
2. ChIP IP样品:是经过染色质免疫沉淀步骤处理后得到的DNA片段。在ChIP实验中,目标蛋白质与特异性抗体结合,然后通过免疫沉淀将目标蛋白质-抗体-DNA复合物沉淀下来。最后,通过洗涤和反交联等步骤去除非特异性的结合物,并将DNA片段从蛋白质上解离出来。
通过比较ChIP Input样品和ChIP IP样品中的DNA片段,可以确定目标蛋白质在染色质上的特异性结合。常用的分析方法包括PCR、实时定量PCR和测序等。