细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取是基本的生物学技术之一，通过提取产生的蛋白质，可以帮助科学家们更加深入地了解细胞的内部结构和功能，甚至可以用于开发药物或诊断工具。下面将介绍细胞蛋白提取步骤。
步骤1：细胞培养
在进行细胞蛋白提取前，需要首先进行细胞培养。具体操作步骤如下：
1.1 选取需要的细胞品系，放入适当的培养基中进行培养。
1.2 培养后的细胞密度需要满足后续实验的要求。一般来说，需要对其进行细胞计数，以确定细胞密度。
步骤2：细胞收集
细胞收集是蛋白提取的前置步骤，需要确保收集到的细胞数量足够，同时需要保证其完整性，避免蛋白质的分解。具体操作步骤如下：
2.1 用PBS(pre-cold phosphate-buffered saline)冲洗细胞，以去除细胞表面的杂质并彻底洗净。
2.2 用PBS去除培养基，收集细胞。
2.3 将细胞置于低速离心机中，离心10 min，将上清液抛弃，留下细胞沉淀，去除剩余的PBS。
步骤3：裂解细胞膜
裂解细胞膜是细胞蛋白提取的关键步骤，目的是将细胞内的蛋白质释放出来。具体操作步骤如下：
3.1 用1 mL的细胞裂解液向细胞沉淀中加入，1 mL细胞接触试剂，使用管床震动器在4℃下震荡5分（若是细胞培养量过大，则需要相应增加对应的试剂用量，立即加入完所有试剂后利用管床震动器在4℃下快速震荡 5 分钟，然后在 4℃下静置 5 分钟）
3.2 再次离心细胞裂解液，将上清液倒入另一个离心管中，丢掉沉淀。留下的上清液即为裂解液。
3.3 用尖端管将裂解液转移至一个离心管中，离心10分钟，将上清液抛弃，留下的沉淀为细胞裂解物。
步骤4：蛋白清洗
蛋白清洗是为了获取更加纯净的蛋白质，剔除掉不需要的物质。具体操作步骤如下：
4.1 加入含有蛋白质的上清液到蛋白检测柱中，检测柱一般使用的为蛋白A或蛋白G，用于特异性亲和捕捉蛋白质。
4.2 用温和的洗涤液清洗检测柱，以去除没有被亲和捕捉到的蛋白质。
4.3 用洗涤液和一些其他试剂对蛋白质进行再次清洗。
4.4 将洗涤后的蛋白质洗劫出来并完全去除残余液体。
4.5 对初步全部检测柱中捕获的蛋白进行清洗，此时可以选择不同的检测柱进行亲和捕捉，提高纯度。
步骤5：蛋白分析
细胞蛋白提取后，需要进行蛋白分析。通过检测蛋白浓度和组成，以确保蛋白质的纯度和质量。常用的蛋白分析方法包括SDS-PAGE和Western blotting。
5.1 SDS-PAGE：利用SDS和PAGE电泳进行蛋白质分离，获得蛋白质的相对分子质量和纯度。
5.2 Western blotting：利用分子特异性抗体，检测蛋白的存在和表达情况。
细胞蛋白提取是基础的生物学技术之一，在实验过程中需要注意细节，并结合不同细胞类型的特点，选择适当的实验方法，以获得可靠且有意义的结果。
