pulldown实验原理
pulldown实验是一种用于识别蛋白质间相互作用的生化实验技术，常被用于生物医学研究中。该技术基于亲和层析技术或免疫层析技术，结合多种化学方法和手段，可以使它在蛋白质相互作用研究中起到重要的作用。
原理
pulldown实验是通过使用特定的抗体或对蛋白质结构的修饰，如简单标记或复杂标记等，使其和蛋白质混合物中的目标蛋白发生特异性反应，从而使其得以分离。
具体步骤
1. 制备对照样品：适当的对照样品可以帮助我们判断是否出现了非特异性凝集，增加实验数据的可靠性。通常把没有相关特异抗体的抗体用作对照。
2. 纯化诱捕蛋白（如蛋白结合的琼脂糖瑞替韦。琼脂糖瑞替韦是一种固定在琼脂糖上的镍离子，可以用于纯化含有6个组氨酸残基的重组蛋白）：首先对分离的蛋白质分别进行量和纯度的检测，然后进行定量。如果需要，就将浓缩的诱捕蛋白用样品缓冲液重新混合。
3. 接触目标蛋白：将诱捕蛋白和目标蛋白共同孵育，通常需要共同孵育数小时或过夜。在孵育过程中，目标蛋白质与诱捕蛋白结合。在几种实验技术中，可以通过光固化交联或瞬时细胞外交联来帮助蛋白质的交联。
4. 用诱捕蛋白分离目标蛋白：将混合物转移到纯化过的琼脂糖瑞替韦或其他相关固定物上。目标蛋白质和结合诱捕键诱捕到其上，而负载和未结合的蛋白质成分则可以轻松地从琼脂糖瑞替韦流去。接下来，用盐水洗涤珠子。
5. 去除实验样品和对照样品：两种样品都需要与相应的抗体混合。使用磁珠法，分别将两种样品吸附到不同的磁珠中。
6. 目标蛋白质行亲和纯化：将琼脂糖悬浮液挤入样品缓冲液中。使用滴定管或微注射器等仪器，向磁珠添加滴定卡带好的抗体。然后振荡，使抗体与磁珠充分混合。接下来，吸出抗体磁珠混合物中的样品液体，深深地沉淀抗体结合的磁珠（形成黑色沉淀）。接下来，用NaCl浓度梯度洗涤琼脂糖消化并释放出蛋白质。在此过程中，目标蛋白质与抗体共沉淀。以蛋白质含量为基础进行SDS PAGE电泳。
7. 确定目标蛋白的基因：实验结果有了之后，将基因与数据库进行比较以获得相关数据，如目标蛋白的分子量和氨基酸序列。这可以让科学家进一步了解目标蛋白。例如，在pulldown实验中成功引起了两种蛋白质的交互作用，则研究者可以使用这种方法，当试验结果中找到该交互作用时，可以验证与此交互作用相关的基因，并标示其基因表达的生理意义。
应用
pulldown实验主要用于研究蛋白质的互作。这些互作可以包括蛋白质与DNA、RNA和其他蛋白质的互作等。有许多不同的分析程序和技能现可用于pulldown实验，从质谱分析和X-射线晶体结构，到小RNA测序和生物信息学分析。
pulldown实验通常用于发现和验证蛋白质交互作用。它可用于检测已知蛋白质间的相互作用，也可以用于发现新的蛋白质交互作用。特别是，在调查新的药理靶标、新的蛋白质互作网络和信息通路方面，pulldown实验可以发挥重要作用。
最近，pulldown技术被改进为更适合在研究中进行操作，这些改进涉及复杂修饰蛋白、组蛋白复合体、膜蛋白、细胞外基质和神经递质等领域。
