探针法qPCR的原理及基本步骤
实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）是一种精确快速的DNA分子检测技术，广泛应用于医学、生物学、食品安全等领域。探针法qPCR是qPCR的其中一种方法，其原理是利用特定探针靶向结合靶分子，完成对靶分子的快速准确定量。以下是探针法qPCR的原理和基本步骤。
一、探针法qPCR原理
探针法qPCR基于PCR技术，PCR是一种体外增生DNA分子的方法，其原理是通过特异性引物引导DNA复制酶复制模板DNA，产生大量特定序列的靶分子。探针法qPCR针对病原体、基因表达、分子标记等领域进行结构、表达的分析。
探针法qPCR基于核酸杂交（hybridization）原理，在PCR反应过程中，引物将DNA分子特异性地复制，而探针则利用高度特异性和亲和性与PCR产物结合。探针的主要作用是：a.携带与荧光萃取器（fluorophore）结合的化学物质（quencher），靶分子与探针结合后，荧光物质与化学物质分离，释放出荧光辐射；b. 靶分子不能与引物结合和探针结合，因此为避免假阳性，探针与引物要特异性地匹配靶分子。
二、探针法qPCR基本步骤
探针法qPCR通常分为两步：反应体系构建和PCR反应实验两个阶段。下面是探针法qPCR的基本步骤：
1. 反应体系构建
在构建反应体系之前，首先需要设计靶分子的探针和引物。引物至少应包含一对特异性引物，靶序列沿PCR产品的边缘，这样如果PCR产品被再次扩增，即使没有探针存在，也不会干扰到实验结果。探针和引物的设计是探针法qPCR成功的关键之一。
构建反应体系时需要选择合适的探针和引物浓度，这样可以保证反应的特异性和灵敏度。普通反应体系由下列各组分组成：引物、探针、dNTPs（脱氧核苷酸）、MgCl2、TaqDNA聚合酶和反应模板。
在实验过程中，如果多个样品需要检测，即可以采用单圆柱反应管，也可以采用96孔板。
2. PCR反应实验
PCR反应实验是探针法qPCR的核心步骤。PCR实验通常分为4个步骤：变性、退火、扩增和终止。
变性：在95℃度下，将两条引物与目的DNA序列变性，其实是将引物和DNA模板分离，这样引物才能更好地与目的序列结合，并反应更有效率。
退火：在60℃度下，引物结合到DNA模板，并且被延长。引物延长与DNA模板上都要有足够的基序，才能相互结合，建立稳定的双链结构。
扩增：在72℃度下，TaqDNA聚合酶能够保持较高的扩增效率。对于一些结构特殊的DNA目的序列，或者一些受限制的环境，如样品中的化学药剂或软组织，PCR反应效率可能会降低；
终止：在50℃-70℃下，qPCR反应中的探针在荧光抑制的作用下与靶分子结合。经过一段时间，荧光抑制被下降，探针荧光释放，为荧光放射提供了依据。荧光强度的大小，与启动荧光放射的分子量呈线性关系。
三、探针法qPCR应用
探针法qPCR广泛应用于生物学和医学科学，如下：
1. 分析特定病原体的存在和数量：例如，探针法qPCR可以用于检测感染病原体例如病毒、细菌和真菌。
2. 研究基因的表达水平：例如，探针法qPCR可以检测来自特定基因转录的mRNA水平。
3. 检测转化的DNA：例如，探针法qPCR可以用于检测基因编辑或转染过程中的转化效果；
4. 检测特定环境下的微生物：例如，探针法qPCR可以检测特定环境中的微生物，以评估环境影响和健康状况；
5. 检测非经典感染性疾病等疾病：例如，探针法qPCR可以检测非经典感染性疾病，如贝伐德病、卡特考茨病等传染性疾病。
总之，探针法qPCR是一种优秀的，灵敏的，专门针对核酸和蛋白质等分子的快速定量检测手段。它具有许多应用前景，可以广泛用于农业生态、基因编辑和基因转化、生物质能等多个领域。
