RNA的反转录有哪些因素值得考虑？
一、RNA模板制备
RNA是反转录的模板。总RNA通常用于RT-(q)PCR等下游应用的cDNA合成，而特定类型的RNA（如信使RNA（mRNA）、miRNA等小RNA）可通过富集而用于某些实验应用，如cDNA文库构建和miRNA图谱分析。
保持RNA的完整性至关重要，在提取、处理、储存和实验过程中均需要采取特殊的保护措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有气溶胶屏障的移液器移液、使用无核酸酶的实验室器具和试剂以及对实验区域进行去污处理。
根据来源材料（如血液、组织、细胞、植物）的类型和实验目标，有多种RNA分离和纯化方法可供选择。分离纯化过程的主要目标是稳定RNA分子、抑制RNA酶，并通过适当的储存和提取方法最大程度提高产量。最佳的纯化方法可以去除干扰酶活性的内源性化合物，如植物组织中的复合多糖和腐殖酸，以及反转录酶的常见抑制剂，如盐、金属离子、乙醇和苯酚。纯化的RNA应保存在-80°C，尽量减少反复冻融。
纯化后评估RNA质量和数量的方法有许多种。常用的方法是利用紫外光谱法检测特定波长的吸光度。RNA质量可通过利用Beer-Lambert定律测定260 nm处的吸光度而确定；不同波长的吸光度比值可以确定是否存在特定污染物。请注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波长的紫外线。对于需要更高RNA特异和更灵敏分析的RNA, 可以考虑使用含染料的荧光试剂，这种试剂只在特异性的与目标分子结合时才会释放荧光信号。
以28S和18S核糖体RNA（rRNA）的比值可评估RNA的完整性。将总RNA变性后进行凝胶电泳，可对其进行定性评估。然后，评估28S rRNA与18S rRNA的强度比，比值为2:1代表完整的RNA。Agilent Technologies开发的一种方法结合了微流体学和专利算法，可定量评估RNA的完整性。该方法可产生数字读数，称为RNA完整性分数或RIN值，数值介于8至10之间代表高质量的RNA。
二、基因组DNA的去除
为去除gDNA，通常在RNA分离过程中加入DNase I。在进行RT-(q)PCR之前，必须完全去除DNase I，因为任何残留的酶都会使单链DNA（如引物和cDNA）降解。通常，DNase I失活（如，EDTA和加热处理）或酶去除步骤会导致RNA降解或样品损失。
作为DNase I的替代品，可使用双链特异性DNase去除污染gDNA，而不影响RNA或单链DNA。
三、反转录酶选择
分子生物学中使用的大多数反转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的pol基因。AMV反转录酶是实验室中首批用于cDNA合成的酶之一。该酶是一种分子量为170-kDa的异二聚体，最佳反应温度范围为42-48℃。AMV反转录酶具有较强的RNase H活性，可降解RNA:cDNA复合物中的RNA，获得的cDNA片段较短（<5 kb）。
MMLV反转录酶因具有单体结构而成为常用的替代品，可对重组酶进行更简单的克隆和修饰。MMLV反转录酶是一种分子量为75 kDa的酶，反应温度约为37°C。虽然MMLV的热稳定性低于AMV反转录酶，但其RNase H活性较低，因此具有更高的长cDNA（<7kb）合成效率。
四、引物选择
为了启动反转录，反转录酶需要一种短DNA寡核苷酸（即引物）与其互补序列在RNA模板上结合，并作为新链合成的起点。根据RNA模板和下游应用，有三种基本类型的引物可供选用：oligo（dT）引物、随机引物和基因特异性引物。
❖ Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，可与真核mRNA的poly(A) 尾退火。其为从真核生物mRNA构建cDNA文库、全长cDNA克隆和cDNA 3'末端快速扩增（3'RACE）的最佳选择。由于oligo(dT)引物对poly(A) 尾的特异性，其不适用于降解的RNA，如来自FFPE样品的RNA，也不适用于缺少poly(A) 尾的RNA，如原核生物RNA和microRNA。由于cDNA合成开始于3' poly（A）尾，oligo(dT)引物可能引起3'末端偏差。具有复杂二级结构的RNA也可能影响全长cDNA合成，导致5'末端的代表性偏低。
❖ 随机引物是具有随机碱基序列的寡核苷酸，通常由6个核苷酸组成，被称为随机六聚体、N6或dN6。由于随机引物的随机结合（即没有模板特异性），其可以退火到样本中的任何类型RNA。因此，这些引物被认为可以用于无poly（A）尾结构（如rRNA、tRNA、非编码RNA、小RNA、原核mRNA）的RNA、降解RNA（如来自FFPE组织的RNA）和具有已知二级结构的RNA（如病毒基因组）的反转录。
❖ 基因特异性引物可提供特异性最强的反转录引物配对。这些引物是根据目标RNA的已知序列进行设计的。由于引物与特异性RNA序列结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当对多种目标进行分析时，则需要使用更多的RNA样本。基因特异性引物通常用于一步RT-PCR实验应用。
总之，反转录实验的成功高度依赖于反应组分和反应条件。以上为关于反转录的一些总结，希望能给大家的实验带来些许帮助。最后，祝大家实验顺利！
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