无缝克隆试剂盒常见问题与处理办法
一、平板上无克隆或克隆数目很少
1.可能的原因：引物序列不正确
解决方案：确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。
2.可能的原因：PCR产物不纯
解决方案：优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物；换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。
3.可能的原因：反应体系中DNA浓度太低
解决方案：在重组反应中，加入推荐的DNA量。
4.可能的原因：不纯的载体或插入片段抑制重组反应
解决方案：推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。
5.可能的原因：转化过程中加入重组反应液过多
解决方案：重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。
6.可能的原因：感受态细胞转化效率低
解决方案：更换新鲜、高效的感受态细胞。
7.可能的原因：培养基中加入错误或过多抗生素
解决方案：在转化平板中加入正确、适量的抗生素。
二、假阳性克隆数目多
1.可能的原因：克隆载体线性化不完全
解决方案：重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。
2.可能的原因：PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染
解决方案：可在PCR反应之前先将模板质粒线性化；PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。
3.可能的原因：转化用平板放置时间过长导致抗性失效
解决方案：确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。
三、克隆含有不正确的插入片段
可能的原因：PCR产物混有非特异性片段
解决方案：优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。
核小体（北京）生物技术有限公司生产的无缝克隆试剂盒15分钟可以将一个 50bp-15kb PCR 扩增片段（平端）克隆插入任意载体的任意位置，且不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端 / 粘性末端的限制，克隆阳性率可达 95% 以上。
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