质粒提取常见问题
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。在分子生物学实验中，通常将目的基因插入到质粒的多克隆位点上，构建新的重组质粒，目的基因可以随质粒载体进入到受体细胞中。获得高品质的质粒对下游实验起到非常重要的作用。
质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA，和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取办法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速、纯度高等特色。其原理是：强碱（pH12.0-12.6）环境下，SDS损坏细胞壁并裂解细胞，一同使宿主细胞的蛋白质、染色体及DNA发生变性，而质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性。pH调至中性时可恢复天然构象，在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积，离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收。
常见问题剖析：
Q：质粒提取的办法有哪些？
能够用于质粒DNA分离纯化的办法有：碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有机溶剂法等，大多数的质粒抽提试剂盒选用的办法是碱裂解法。针对于一些分子量大、仿制数低的质粒DNA，仅用试剂盒提取还很难取得高纯度、高浓度的质粒，需求试验者在理解质粒提取原理的基础上，针对不同的菌种、不同的质粒，有用操控提取过程中的各种要素，才能取得理想的成果。
Q：影响质粒提取的要素有哪些?
质粒提取的纯度和得率与许多要素相关，比如：质粒本身的仿制才能、安稳性、宿主菌株的品种和培育条件、菌体裂解是否充分、抗生素、硅胶膜的吸附才能、试验者操作的熟练度等等，都会影响到质粒的提取作用。
Q：提不出质粒或质粒提取量很少
1.菌体中无质粒
有些质粒本身不能在某些菌种中安稳存在，经屡次摇菌后可能导致质粒丢失。
2.菌种老化
假如是甘油菌，主张涂布平板培育后，重新挑选菌落后再进行液体培育。
3.质粒拷贝数低
某些质粒归于低仿制类型，也会引起质粒提取量低，尽量换用相同功用的高仿制质粒，或许一同添加菌体和试剂的运用量。
4.碱裂解不充分
质粒提取过程中，并非菌体量越高提取量越高，运用过多的菌液，会导致菌体裂解不充分，可适当添加下流提取试剂的运用量或减少菌液用量。
Q：质粒中基因组污染是怎样发生的？
基因组污染一般是因为操作过于剧烈发生的，假如选用涡旋振荡的方法来进行混匀，基因组DNA会被剪成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一同被回收。所以在质粒提取过程中，动作要尽量温和。
Q：为什么有些质粒，纯化后长时间放置会降解？
发生这种现象的主要原因是核酸酶污染，除了在制备时简单引进外源核酸酶之外，质粒宿主细胞也会影响抽提质量，JM系列细胞中含有丰富的核酸酶活性，假如制备的质粒需求长时间保存，主张替换宿主细胞，如DH5α、XL1-Blue，用于抽提质量质粒。
Q：之前测序没问题的菌液，37℃扩大培育后，质粒的巨细或序列出现异常？
这种情况一般出现在大质粒或较特别的序列中，可能是在大肠杆菌中仿制时发生了重组，能够替换重组酶缺失的菌株，比如JM109、sure菌株，使质粒仿制愈加安稳。
Q：质粒的拷贝数由什么决定的？
质粒依据仿制特性能够分为严紧型和松懈型，严紧型质粒在宿主细胞中仅含有1-2个，它的仿制与宿主细胞染色体受相同要素的操控，在必定的细胞周期内仿制。严紧型质粒分子量较大，比如F质粒和P1质粒。而松懈型质粒在宿主细胞中含有十几个，乃至是几十个，在整个细胞成长周期中能够随时仿制。松懈型质粒分子量较小，比如pBR322（15-20copies）、ColE1（20-30copies）、pUC（30-50copies）质粒。一般情况下，质粒的仿制数是由其仿制子（ori的品种）决定的，有时也会遭到宿主细胞的品种、细胞的培育环境的影响。
Q：常见的低仿制质粒是严紧型质粒吗？
商业化载体都归于松懈型质粒，但质粒的仿制数有所不同，比如植物表达载体pBI121，载体上含有从ColE1来历的ori仿制元件，虽然也是松懈型质粒，但相对于pUC质粒来说，仿制数较低，在质粒提取时，需求较大的菌体量，取得的质粒量才能到达试验需求。pBR322也是我们常见的一款低仿制质粒，包括一个仿制起点（ori）、一个Ampicilin抗性片段（AmpR）和一个tetracycline抗性片段（TetR），能够作为载体骨架，构建各类载体。pBR322的仿制子并不是一个能诱导超高仿制才能的起点，但也能够保证每个宿主细胞包括15-20个质粒。
针对于这类质粒，能够在得到部分成长的细菌培育物中参加氯霉素继续培育若干小时，氯霉素能够抑制宿主细胞中蛋白质的合成，阻挠细菌染色体的仿制，但是松懈型质粒仍可继续仿制，在参加氯霉素的若干小时内，仿制数继续递加。
Q：应该选择什么等级的质粒？
不同等级的质粒适合于不同的下流试验，假如下流用于酶切、测序、亚克隆、转化和基因表达等常规分子生物学试验，手提和试剂盒提取制备的质粒均能达到需求。假如下流需求将质粒转染至细胞中或许显微注射到试验动物体内，则要求质粒的内毒素含量和超螺旋比例达到必定的标准。内毒素会影响质粒的转染功率和转染后细胞状况，质粒超螺旋比例越高，其转染功率及表达量也会越高。
核小体（北京）生物技术有限公司的质粒提取试剂盒离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。 独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如 JM 系列、 HB101 也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、 纯度好， 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
