组织细胞总RNA提取失败常见原因及分析
1.液相没有完全分开，混匀和匀浆不充分。通常此类问题是由于加了氯仿之后不充分的混匀以及随后在比较高的温度下离心引起。正如实验操作流程中第3 和第4 步所述，在加入氯仿后必须剧烈摇动混匀至少15s，并且随后在4℃或者不高于8℃的温度下离心，较高的离心温度会破坏溶液分层。
2.纯化柱堵塞，匀浆不充分。不充分的匀浆可能导致大块组织残留堵塞纯化柱，必要时请增加离心场和离心时间。起始样品太多起始组织样品不宜超过100mg，必要时请减少样品用量。
3.RNA 降解样品或素材保存环境太差状态不好，或者经过某些药物处理的细胞或组织中的RNA 有可能会发生自发的降解。请将标本存放于-80℃或者液氮中。如果能加入一些商业化的RNA 酶抑制剂（如RNA Later），效果会更好。
4.样品采集。在采集到组织标本后尽快使RNA 酶丧失活性对防止RNA 降解是至关重要的。另外，请尽量缩短处死到取样的时间，这样才能保证高纯度RNA 的高得率。裂解前样品操作在把组织样品投入裂解液前，请保持冷冻的状态，在样品解冻之前，尽快将其投入含RNA 酶抑制剂的裂解液中，然后立即匀浆。离心条件加入氯仿之后的离心请务必在4℃。
5.电泳图显示降解。如果在电泳时总RNA 上样超过5μg，单一泳道中的总RNA 条带就会出现弥散和拖尾现象。一般电泳时总RNA 的上样量为700ng 至800ng 左右。外源RNA 酶的污染在抽提总RNA 的过程中，务必防止外源核酸酶的污染，整个过程始终需戴手套，并且经常更换以防止“手指残留RNA酶”污染。研钵和研杵必须在180℃下烘烤过夜，以除去残留的RNA 酶。所有的离心管和吸头必须用DEPC 水浸泡并高压灭菌后方可使用。
6.RNA 降解是由于核糖核酸酶（RNase）造成。这是一种非常稳定和高活性的酶，尽管试剂盒中提供的耗材和试剂都是无RNA 酶的，但是RNA 酶会存在于整个工作环境中，比如双手，实验工作台和其他设备，因此很显然，RNA 样品可能在抽提中或者之后的保存过程中污染到RNA 酶，所以我们提出如下预防措施：1)请使用无RNA 酶和一次性的用品。2)用含RNA酶抑制剂的溶液来清洁工作台面以及相关设备。3)操作试剂和RNA 时请带上乳胶手套。4)尽快采集组织样品，避免组织样品接触到任何表面。5)在进行下游操作分析时，请始终把RNA 样品置于冰上。6)将RNA 样品分装后储存于-70℃，减少操作中反复冻融。7)使用去垢剂溶液清洁电泳槽，在电泳时请用DEPC 水防止RNA 降解。8)请用试剂盒中提供的无RNA 酶水稀释RNA 样品。
7.低得率RNA 的得率的变化是非常普遍的现象，但是RNA极端的低得率可能由于抽提的失败而导致。很多因素会降低RNA 的得率，例如低质量的组织样品，不充分的匀浆以及低效的洗脱。因此，选取高质量的组织样品并进行合理的操作是非常重要的，在Ezol 中充分的匀浆组织对于RNA 的获得也是必要的，另外在一些情况下，RNA 的低得率是因为低效的洗脱，适当的延长洗脱时的孵育溶解时间有助于提高RNA 的得率。
8.A260/A280 比值偏低。通常A260/A280 比值偏低是由于在水中测量吸收值，或者是由于酚和其他有机药品的污染造成。在一般情况下，分离出的RNA 应该不含酚和其他有机药品。另外，不充分的匀浆可能导致蛋白和核酸的共纯化，从而使280nm 处的吸收值增大。我们推荐您按照手册中的标准流程消化和匀浆组织样品，另一方面，也推荐您在10mM 的Tris-HCl 溶液中测量RNA 的A260/A280 比值。
9.总RNA 储存RNA 应溶解于无RNA 酶的水里，一般没有必要额外添加其他试剂，如RNA 酶抑制剂或者RNA 稳定剂。洗脱的RNA 可以储存于-70 ℃或者-20℃，如果长期保存，我们推荐在-70 ℃。在这种低温环境下，3 年后也并未观察到RNA 有显著的降解。为了防止由于反复冻融而造成的RNA 降解，请分装后储存。
10.总RNA 质量的判定完整性通常经过溴乙锭染色后，胶上会呈现出两条锐利的条带，它们分别是18s 和28s 核糖体RNA。一个具有良好完整性的RNA 样品，28s 和18s 的强度比应接近2:1。
11.纯度本试剂盒将传统的胍盐/酚/氯仿法和纯化柱相整合，在试剂盒所述的步骤和环境下能分离出高质量的RNA，因此，我们不推荐您检测RNA 的纯度，然而由于某些原因，用户想证明其纯度，这样的话用A260/A280 的吸收比值可以对RNA 的纯度作大概评价。通常来说，高纯度RNA 样品的A260/A280应在1.9~2.1 之间，然而该吸收比值容易受PH 变化的影响，因为水不是缓冲体系，因此在水中测量的A260/A280 会略低于在缓冲液中测量的结果，并且结果之间会有很大的差异，结果可能导致一些误解，例如样品是否被蛋白、酚或者其他有机试剂污染，因为这些污染都在280nm 处有高吸收值。所以，为了结果的准确性，我们推荐您在10 mM Tri-HCl (pH 7.5) 的缓冲体系中测量，并用相同的缓冲液校准紫外分光光度计。
注意：RNA 浓度必须在水中测量，因为吸收值和RNA 浓度之间的换算关系取决于RNA 在水中的消光系数。
核小体（北京）生物技术有限公司生产的组织、细胞RNA提取试剂盒，采用新型硅胶柱提取方法，完全不含苯酚、疏基乙醇等有毒试剂，安全快速，是您实验的不二选择。
