一些特殊组织的RNA提取
1、纤维组织:心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于彻底破碎组织。这些组织细胞密度低,单位重量的组织RNA的含量就少,建议用尽可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纤维组织终RNA,由于纤维组织终RNA含量较少,可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量,并在液氮中将组织彻底磨碎,同时适当减少溶解RNA的溶液体积。
2、蛋白/脂肪含量高的组织:动物的脑和某些特殊的植物组织中,脂肪或者蛋白的含量很高,可以采用TRNzol来提取此类样品中的RNA。在该提取过程中,用氯仿抽提后,如上清仍含白色絮状物,必须用氯仿再次对上清进行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的组织中RNA时,用氯仿抽提后会分成油滴、水相(含RNA)、DNA中间层、有机相四层,应用移液管小心吸取水相液体,避免吸到油滴层和DNA层。
3、核酸/RNase含量高的组织:脾、胸腺、胰脏等组织的核酸和核酸酶含量很高,可以在液氮中碾磨组织,再快速匀浆。如果裂解液太粘稠(因为核酸含量高的缘故),酚/氯仿抽提不能有效分层,可以加入更多裂解液以解决此类问题。如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成则表明有DNA污染,可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提,去除DNA污染。RNA产物中的DNA去除可以选用DNaseⅠ进行消化。
4、植物组织和真菌组织:植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂,因此为了避免出现内源酶作用使 RNA降解的现象,一般选择在液氮条件下对植物或者真菌材料进行碾磨。如果降解问题不能解决,基本上是由于样品中的内含杂质导致。许多植物和真菌中的内含杂质如多糖、多酚等都会残留,因为这些杂质分子与RNA有一些相似性,可以与RNA同时沉淀或者吸附,因此在植物和真菌组织的RNA提取过程中,需要用一些特别的步骤或者特别的试剂来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。
5、临床样本:从人组织中提取RNA常常表现出与实验动物提取RNA时不同的困难,实验发现临床类样本RNA的质量通常不好,支原体污染的现象也时常有,该类临床样本准备时应注意防止支原体污染。
临床样本RNA质量差与其组织采集有莫大的关系。通常临床样本的采集过程耗时会比其它样本更久,而样本采集过程为确保RNA具有较高的完整性,要求样本的采集必须新鲜,采集过程速度要快,而大多数临床样本在采集之前可能还去做了活体切片或是器官移植,等正式采集的时候可能尸体已经停放好几天了,这些因素基本确定了总RNA的质量不会太好,临床样本的最佳采集时间是其濒死期即死亡前的组织。
核小体开发的组织细胞 RNA 快速提取试剂盒采用硅胶模提取技术,能完美替代传统有毒TRNzol法,且该试剂盒DNA 清除柱技术能确保有效清除 gDNA 残留,得到的 RNA 不需要 DNase 消化,可直接用于反转录 PCR、荧光定量 PCR 等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞 RNA酶,然后裂解混合物通过一个基因组 DNA 清除柱,基因组 DNA 被清除而 RNA 穿透滤过。滤过的 RNA 用乙醇调节结合条件后,RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗—离心步骤 , 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的 RNase free H 20 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。