植物DNA提取背后的化学原理
高质量DNA的分离是分子研究的前提。与动物相比，在植物DNA提取过程中保持DNA的产量和质量是一项艰巨的任务，因为其刚性的细胞壁由纤维素和其他可变含量的化学成分（例如多糖，多酚，蛋白质）组成。这些成分的量根据植物种类，使用的植物部位，环境条件和生长阶段而变化。例如，谷物富含碳水化合物，而药用植物富含多酚，其中胁迫植物具有更高的多酚。
今天大多数植物DNA分离方案都是十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取方案的改进版本。通常根据提取的植物种类和植物部位，对提取过程中所用化学物质的浓度进行修改。因此，了解在DNA提取过程中使用的每种化学物质（即CTAB，NaCl，PVP，乙醇和异丙醇）的作用将有助于实现更好的提取效果。
CTAB提取液组成
CTAB缓冲液主要包括CTAB，氯化钠（NaCl）和乙二胺四乙酸（EDTA）Tris2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（TRIS），聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和β巯基乙醇。
CTAB
植物细胞将自身包裹在复杂的多糖细胞壁中，其中纤维素是主要成分，由于链状结构和分子间氢键作用，其本质上是结晶的。通过与CTAB缓冲液或液氮一起施加在研磨过程中施加的机械力，可以削弱它来打开细胞壁。
细胞膜紧靠细胞壁，由多种磷脂分子和蛋白质组成。它溶于表面活性剂，去污剂中，而去污剂本质上是两亲性（疏水性尾部和亲水性头部），与磷脂膜非常相似。离子表面活性剂一直以来在使蛋白质分子变性以及在溶解膜方面表现良好。
阳离子CTAB构成一个长的疏水性烃链和一个亲水基。由于两亲性，它在水中形成胶束。根据溶液的离子强度，CTAB的工作方式有所不同。在低离子强度下，它会沉淀出核酸和酸性多糖（果胶，木聚糖和角叉菜胶），而蛋白质和中性多糖（葡聚糖，刺槐豆，淀粉和菊粉）则保留在溶液中。但是，在高离子浓度下，它会与多糖结合并形成复合物，随后在氯仿萃取过程中将其除去，此外它还会变性或抑制蛋白质和/或酶的活性。
氯化钠
NaCl有助于去除与DNA结合的蛋白质。通过中和DNA上的负电荷，使分子可以聚集在一起，这也有助于使蛋白质保持溶解在水层中，以使它们不会与DNA一起在醇中沉淀。
当细胞受到低渗或高渗溶液作用时，就会发生渗透作用。如果将细胞保持在低渗溶液中，水会进入细胞内部，从而导致肿胀，内部压力升高并最终破裂。另一方面，在高渗溶液中，水倾向于从细胞中渗出，并最终使植物细胞收缩和皱缩，从而导致细胞质溶解。因此，盐浓度在细胞裂解中起重要作用。
Tris
Tris是分子式为（羟甲基）氨基甲烷，具有三个伯醇和一个胺基，是pH介于7和9之间的有效缓冲液。与HCl一起，它包含弱碱及其共轭弱酸的混合物，可以充当缓冲剂并进一步增加细胞壁的通透性。在组织研磨过程中，当细胞壁和细胞膜破裂时，细胞质物质被释放，因此pH值被改变，从而破坏了生物分子（如核酸）的稳定性。在这种情况下，缓冲液起着重要作用，Tris缓冲液可保持溶液的pH值。
EDTA
EDTA螯合二价阳离子，例如Mg 2+和Ca 2+，它们存在于酶中，并降低DNase和RNase的酶活性。例如，DNase酶需要Mg 2+离子作为其活性的辅助因子。用EDTA螯合Mg 2+离子会使DNase酶失去功能，从而保护DNA。核酸与蛋白质的聚集也需要Mg 2+离子。而Ca 2+离子对于细胞壁中间层的固结和膜的稳定性是必需的。
β-巯基乙醇
植物富含酚类化合物，为了获得高质量的DNA，应将其除去。β-巯基乙醇是一种强力还原剂，用于清洁植物粗提物中存在的单宁和其他多酚。
同时因为球状蛋白质溶解在水中，为了使它们不溶使用β-巯基乙醇会还原蛋白质的二硫键从而使蛋白质变性。
PVP
加入PVP可以从植物DNA提取物中去除酚类化合物。多酚是药用植物，木本植物和成熟植物部位的主要成分。它存在于液泡中，而其氧化酶多酚氧化酶（PPO）位于质体中。在组织的研磨过程中，PPO将多酚转化为醌，从而产生褐色。多酚会与DNA沉淀在一起，从而与DNA结合并使其下游变得困难。PVP由通过氢键结合多酚，因此可以防止多酚氧化。
苯酚
苯酚是一种有机溶剂，因此不可与水混溶，可与氯仿和异戊醇一起用于DNA纯化，以去除蛋白质和多糖污染物。当苯酚与细胞提取物一起摇动时，细胞的非极性成分将在苯酚中分馏，而将极性成分留在水中。DNA不溶于苯酚，因为苯酚是一种非极性溶液。另一方面，由于不同氨基酸的长链，蛋白质中同时存在极性和非极性基团。不同的氨基酸在其侧链上具有不同的基团。同样，蛋白质折叠成二级，三级和四级结构取决于氨基酸的极性。
以25：24：1的比例进行苯酚：氯仿：异戊醇的离心后得到三层，即水相，中间相和底部有机相。在中性至碱性pH值下，核酸带负电且呈极性。因此，它是亲水的并且保留在水相中。在水溶液中，疏水性氨基酸形成保护核。但是，变性后，非极性核（疏水性）会暴露出来，从而导致蛋白质和某些多糖在相间沉淀。
苯酚-氯仿的结合减少了poly（A）和mRNA在有机相中的分配，并减少了在相间不溶性RNA蛋白复合物的形成。苯酚保留了大约10–15％的水相，这导致类似的RNA损失。氯仿可防止水份保留，从而提高产量。
只能使用中性苯酚，因为酸性苯酚会溶解其中的DNA，或者苯酚会通过氧化作用变成醌，并形成自由基并降解核酸。
氯仿
氯仿一种非极性（疏水）溶剂，非极性蛋白质和脂质在其中溶解，从而促进脂质和细胞碎片向有机相中的分配，使分离的DNA在水相中得到保护。氯仿具有较高的密度（1.47 g / cm 3），可确保两种液体的相分离，并迫使有机相和水相更清晰地分离，从而有助于去除水相，同时最大程度地减少与有机相的交叉污染。由于氯仿本质上是挥发性的，因此它不会阻碍下游过程。
异戊醇
三氯甲烷与空气接触并形成有害的气体光气。如果仅使用氯仿，气体截留会产生泡沫或起泡，在萃取过程中会在两相之间起泡沫，使DNA难以正确纯化，此时氯仿与异戊醇或辛醇可以防止溶液的乳化。
核糖核酸酶A
RNase A是一种内切核糖核酸酶，可催化两步反应中5'-酯键处RNA的3'，5'-磷酸二酯键的水解。第一步是转磷酸作用，得到终止于嘧啶2'，3'-环状磷酸酯的寡核苷酸。第二个是环状磷酸酯的水解以产生末端3'-磷酸酯。因DNA缺少关键的2'-OH，因此无法被RNase A消化。
异丙醇/乙醇
酒精用于将DNA从提取溶液中沉淀出来，DNA保持溶解在水溶液中，因为DNA具有磷酸二酯主链，其本质上是亲水的。水分子通过形成氢键在DNA周围形成水合壳。异丙醇/乙醇用于沉淀DNA，破坏水合壳。异丙醇是沉淀DNA的好选择。异丙醇的需求量较少（上清液的体积为0.6–0.7体积），因为异丙醇比乙醇具有更高的降低水介电常数的能力，并且还需要大量的盐才能起作用。具有额外的2'OH的RNA保持与水结合的氢比DNA倾向于保持更易溶于水，因此可以选择性地沉淀DNA。异丙醇也可溶解非极性溶剂，例如氯仿，因此也可以去除之前步骤中的杂质。
通常使用冰冷的异丙醇，但许多研究人员表示应在室温下使用，否则也会沉淀多糖。尽管低温下DNA的产量会增加，但它可能会增加杂质。
乙酸钠/乙酸铵/乙酸钾/氯化钠/氯化锂/氯化钾
盐在提取方案中的作用是中和DNA糖磷酸骨架上的电荷。pH 5.2的乙酸钠通常与乙醇一起用于核酸沉淀。在溶液中，乙酸钠分解成Na +和[CH 3 COO] -。带正电的钠离子可中和核酸糖磷酸骨架上PO 3-上的负电荷，从而减少DNA分子之间的排斥，使DNA分子的亲水性大大降低，因此在水中的溶解度也大大降低。
乙醇
用70％乙醇洗涤DNA沉淀物，以冲洗过量的盐，离心，并丢弃乙醇，将DNA留在沉淀物中。将沉淀物风干或真空干燥。应避免过度干燥，因为DNA会将以后很难溶解。
Tris-EDTA（TE）缓冲液/无菌水
在较早的DNA分离方法中，DNA过去需要干燥保存并在需要时进行稀释。如今，对于长期存储，谨慎地将DNA存储在保持其pH值并防止其降解的缓冲液中。TE缓冲液包含Tris（10 mM）和EDTA（1 mM），其中Tris是缓冲成分，EDTA是螯合成分。对于DNA分离，通常将pH设置为7.5-8.5，TE缓冲液的弱碱性也可以防止酸水解的机会，因为酸水解可能进一步破坏水中DNA的稳定性。
TE缓冲液的Tris氨基成分具有保护DNA链在固态和流体溶液中不受辐射损伤的能力。当辐射产生自由基时，它可能会破坏DNA链。因此，在环境温度下的流体溶液中，Tris通过清除羟基自由基起作用。
EDTA的目的是在DNase或RNase作用所必需的溶液中螯合Mg 2+离子，从而保护DNA免受DNase或RNase的侵害。
无菌水可用于短期DNA的存储。如果将TE缓冲液用于DNA的存储，则应使用无菌水进一步稀释以稀释EDTA浓度，以使镁离子可用于PCR期间的聚合酶活性，因为如果随后必须将DNA发送进行测序，则TE中的缓冲液成分会阻碍DNA的扩增。
