如何获取高质量RNA

获取高质量RNA的步骤

获取高质量RNA是进行很多分子实验（比如反转录定量PCR（RT-qPCR）、二代测序转录组分析、芯片分析、数字PCR、northern分析及cDNA文库构建等）的第一步，常常也是最重要的一步。为了获得最灵敏的生物学相关结果，在实际进行RNA纯化之前、之中及之后，会有很多重要的步骤。接下来的应用说明中讨论了样品收集、保存及RNA提取流程中的多个最佳实例，以最大化样品RNA的得率和质量。

优化RNA制备及分析

RNA制备及分析过程进行优化的研究流程中的若干个关键点，而且常常被忽视：RNA提取前对样品的处理及操作，RNA制备的技术选择，制备好的RNA样品的储存。

大多数传统的RNA提取方法都是在RNA酶抑制剂（通常为强去污剂，如胍盐、十二烷基硫酸钠（SDS），或者是用于降低样品中RNA降解风险的苯基化合物等）存在的条件下进行的。然而，通常在RNA提取过程前后才是RNA完整性受损的风险最大的时候。

样品收集及保护

根据材料的不同，找到最适当的细胞或组织裂解方法是最大程度提高RNA制备产量和品质的关键。在RNA提取的样品破碎过程中，在细胞破碎的同时让细胞内含物与裂解液或变性剂充分接触是非常重要的。

这一点会比较麻烦：组织或细胞比较坚硬（例如骨骼，根等）；样品中含有细胞壁或细胞小室（例如酵母、革兰氏阳性菌、孢子等）；工作流程决定了收集样品后无法第一时间进行处理（例如，样品收集之后需要转运到其它地方进行样品处理）；样品数量很多难以快速处理。解决上述问题的一个常用方法是用液氮或干冰冷冻组织/细胞。通常对冷冻样品都要进行预处理以选择所需的重量或在用变性剂处理前先部分磨碎样品。

rna制备

目前有多种RNA制备技术可供使用，一般可归纳为四种通用技术：有机试剂萃取方法，离心柱法、磁珠法和直接裂解方法。虽然这几种方法都可以用于制备高质量RNA以用于多种分析技术，不过在选择合适的纯化方法时还是有几点需要注意。

样品是否特别难处理？

含有大量核酸酶的组织或脂肪组织，以及含有大量抑制因子的样品可能会导致某些问题。

需要处理多少样品？

大体积的样品要求试剂盒中的试剂可成比例放大。通常情况下，样品体积越大，则通量越小。

需要什么样的通量？

某些处理方式非常适用于更高通量及自动化。

有机试剂萃取方法被认为是RNA制备中的金标准。在纯化过程中，样品在含有苯酚的溶液中进行了均质化然后离心。在离心过程中，样品会分为三层：下部的有机相，中层含有变性蛋白质及gDNA，而上层水相则含有RNA。然后将上层水相分离出来并通过乙醇沉淀及再溶解来获得RNA。

有机试剂萃取法的优势

可以快速变性核酸酶并稳定RNA

可调整的通量

有机试剂萃取法的缺点

有机试剂有毒

费力的手动处理流程

难以自动化操作

RNA定量是大多数RNA分析方法之前的重要及必需步骤。这里我们讨论了三种常用定量RNA的定量方法及每种方法的优化技巧。

UV光谱分析

传统的评估RNA浓度及纯度的方法是UV光谱分析。对稀释的RNA样品测量其260及280 nm处的吸光值，根据Beer-Lambert法则（预测吸光度及浓度间的线性变化（图3）

在该公式中， A260读数为1.0相当于~40 µg/mL的单链RNA。而A260/A280比值则可以用来评估核酸纯度。A260/A280 比值在1.8-2.1之间时意味着高纯度的RNA。UV光谱分析是最常用的定量RNA的方法。该方法很容易实施，而大多数实验室中都有UV分光光度计。该方法具有一些缺点，不过通过以下技巧可以最小化这些缺点的影响：

该方法无法分辨RNA和DNA，可以首先用无RNase的DNase来处理RNA样品以去除污染的DNA。

其他污染物如残留蛋白质及苯酚等会影响到吸光度读数，所以在RNA纯化过程中要特别注意将它们去除。

对样品的读取是在石英比色皿进行的。脏的比色皿和灰尘微粒会使320nm处的光发生散射，从而会影响到260 nm处的吸光值。由于蛋白质或核酸都不会吸收320nm的光，所以通过读取空比色皿（仅有稀释液）在320 nm处以及260 nm和280 nm的读数可以进行背景校正。

A260/A280比值同时依赖于pH值及离子强度。当pH升高时，A280读数会降低，而A260则不受影响。这会导致A260/A280比值的升高[1]。由于水通常都具有酸性pH值，它会降低A260/A280比值。我们推荐使用弱碱性pH的缓冲溶液，例如TE (pH 8.0)等，作为稀释液（及空白对照）来确保得到精确的可重复的读数。

确保稀释后的RNA样品处于分光光度计的线性范围之内。通常吸光度读数应该在0.1到1.0范围内。溶液吸光度读数在该范围外时是无法进行准确测量的。通常来说浓度较低时发生的错误也更大。