构建一个质粒需要多久？
质粒一个构建需要多久？
答曰：顺利的话从头到尾也不会超过一周
引物设计
引物设计前，我们需要了解质粒的序列和图谱。以pLVX-Puro为例，我们最需要了解的有：酶切位点、标签以及抗性。
1、酶切位点选择启动子后面的MCS区的酶切位点，需要确认的有（1）酶切位点在质粒上是单酶切.（2）在目的基因上不能有所选择的酶切位点.（3）为了避免载体自连要确保两个酶切位点产生的黏性末端不能互补。（4）两个酶切位点不能离的太近，至少不小于5bp，隔得远一点质粒酶切的时候效果更好。如图质粒我选择的就是实验室最常用的Xhol和EcoR I两个酶切位点。
2、根据需要选择带各类标签的载体。如果载体上不带蛋白标签，并且你需要的标签比较小（比如HA tag，只有十几bp）可以直接通过引物把标签连到载体上。
3、抗性，主要有氨苄抗性和卡那抗性，小心别用错抗生素啦，不然当然啥也长不出来啦
知道保护碱基怎么加要加几个够用不？不加保护碱基后果很严重！做个比喻，如果你的目的基因是根筷子，那么从中间掰肯定容易掰断，但是你从一端掰就难的多，所以加保护碱基的目的就是为了让限制酶工作的时候“省力”。事实上，关于要加几个保护碱基才能省力。
其他的，引物长度一般在16bp-30bp，加长其实也没事，最长的试过50-60bp;GC%一般50%左右，最好不要超过40%-60%这个范围，不然引物很可能结合不上去啦（其实我在迫不得已的情况试过70%GC，最后，建议不要轻易尝试，另外正反引物GC差不超过10%；Tm值，50-70℃，正反引物Tm差也不超过10℃，如果Tm值比较高，建议可以使用退火温度和延伸温度一样的PCR程序。
酶切
酶切有两步，一个是载体的酶切，一个是目的基因的酶切。
首先载体酶切，如果你的载体是空载，并且两个酶切位点比较近，那么建议单酶切回收在后再单酶切，而且酶切之后通过电泳是鉴别不了，是否切开了的，只能在涂板后验证。
如果两个限制酶的最佳工作温度不一样，也建议单酶切+单酶切，保证两个酶都能高效作用。个人不太喜欢空载，喜欢用之前别人连了外源基因的载体，这样切下来之后跑电泳的时候就可以清晰的看到两条带了，一条线性载体的带，一条切下来的外源基因的带，切没切开一目了然。
然后是目的基因的酶切，会发现酶切前后条带没什么差别，毕竟只切了一个碱基，不过没关系，只要确保你的目的基因大小正确，之前设计引物保护碱基也没问题。
连接
连接体系很重要，目的基因和线性载体一定要严格按照比例添加，其实这个只要认真阅读连接酶的说明书就会看到。举个例子，如果目的基因800bp，线性载体8000bp，那么按物质的量来算，连接体系中目的基因最好是加线性载体的10倍。比如一个10ul的连接体系，需要0.03pM的线性载体+0.3pM的目的基因。其他，比如连接酶不能剧烈震荡，连接体系加好不要有气泡，这些都是需要注意的。
转化
1、阳性对照：如果用的是空载的质粒就直接拿完整的空载环状质粒做对照，这样可以鉴别培养基抗性是否准确，转染过程是否存在问题。
如果用的是之前别人插入外源基因的质粒，那么回收的时候把线性载体和外源基因都回收下来，然后再用回收的片段去连接，这样不仅可以排除抗性和转染操作的问题，还可以检验的连接酶是否正常。如果酶切后连接原片段都连接不上，估计该换链接酶啦
2、阴性对照：将回收后的线性载体加连接酶做转化，看是否有菌落。如果菌落比较多，那么可能是单酶切之后自连了。
总结：正常情况菌落数量：阳性对照>实验组>阴性对照，其中阳性对照一般特别多菌落，实验组至少要十几个，阴性对照基本没有菌落，最多不超过5个。
PCR检测质粒阳性情况
当挑了单克隆之后，为了省力，可以做一个菌液PCR，用目的基因的引物去扩增质粒。
